Er wuchs in Culoz (Département Ain) auf. Zusammen mit seinem Bruder Henri entwickelte er den ersten Dampferzeuger mit unmittelbarer Verdampfung. Das Prinzip hatten sie eher zufällig entdeckt. Der Kessel wurde am 25. Oktober 1879 zum Patent angemeldet, dieses wurde 1881 erteilt.
Serpollet lebte mittlerweile in Paris und war als Schreiner tätig. In seiner Freizeit studierte er angestellt am Conservatoire National des Arts et Métiers (CNAM) Ingenieurwesen. Darüber hinaus arbeitete er an seinen Entwürfen für Dampfkessel und Dampfwagen. Bis 1886 hatte er einen beträchtlich vereinfachten Kessel fertiggestellt und patentiert.
Im Fabrikanten Larsonneau fand er einen begeisterten Partner, der der größte Investor für das Unternehmen „Société des Moteurs Serpollet Frères“, das die Brüder 1886 in Paris gemeinsam gründeten, wurde.
Hier entstand mit dem Serpollet-Dampfdreirad eines der ersten industriell gefertigten Kraftfahrzeuge. Es hatte einen ölgefeuerten Serpollet-Kessel und eine für damalige Verhältnisse recht fortschrittliche Vierkolben-Dampfmaschine mit Tellerventilen und Kurbelgehäuse. Léon Serpollets von der Stadt Paris im Juli 1888 ausgestellte Erlaubnis zum Fahren auf öffentlichen Straßen dürfte der erste Führerschein der Welt gewesen sein, den er aber bald wegen Fahrens mit zu hohen Geschwindigkeiten wieder abgeben musste.
Vier in Lizenz gebaute Serpollet-Dampfdreiräder waren die ersten selbstgebauten Automobile der Brüder Peugeot, die auch als Peugeot Typ 1 in die Automobilgeschichte eingingen.
Im Januar 1890 unternahm Léon Serpollet, begleitet von seinem Freund, dem Luftfahrtpionier Ernest Archdeacon (1863–1950), in einem der in Lizenz gebauten Peugeot eine Fahrt von Paris nach Lyon um dort Produktionsräume zu besichtigen. Die beschwerliche, von zahlreichen Pannen unterbrochene Winterfahrt dürfte die erste motorisierte Geschäftsreise der Geschichte gewesen sein.
Nachdem der Benzinmotor ab Mitte der 1890er Jahre die Dampfmaschine bei Personenwagen zunehmend verdrängte, verlegte er sich auf Dampflastwagen und -busse.
Finanzielle Probleme im Unternehmen führten dazu, dass im Jahr 1905 Anteile Alexandre Darracq verkauft wurden. In Suresnes wurde der Bau einer Nutzfahrzeugfabrik neben dem Darracq-Werk begonnen. Deren Fertigstellung erlebte Léon Serpollet nicht mehr; er erlag, erst 52-jährig, im Februar 1907 einem Kehlkopfkrebs.
Neben seiner Tätigkeit als Konstrukteur und Hersteller von Fahrzeugen fuhr Léon Serpollet – mit allerdings mäßigem Erfolg – einige Rennen.
Er hielt aber als erster Fahrer eines nicht-elektrisch angetriebenen Fahrzeuges den Landgeschwindigkeitsrekord über den Fliegenden Kilometer. Sein eiförmiger Dampfwagen Œuf de Pâques (Osterei) erreichte am 13. April 1902 in Nizza auf der Promenade des Anglais eine Geschwindigkeit von 120,8 km/h. Damit brach er den Rekord von Elektroautokonstrukteur Camille Jenatzy aus dem Jahr 1899, der als erster Mensch mit einem Fahrzeug schneller als 100 km/h gefahren war.
